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用Solution ELISA 方法检测食蟹猴血清中的抗药抗体(ADA)
来源: | 作者:exhibition-100 | 发布时间: 2019-06-26 | 207 次浏览 | 分享到:

摘要

       随着生物大分子药物疗法越来越普遍,临床前和临床试验中对生物大分子药物的免疫原性评估(即抗药抗体检测)也面临独特挑战,目前ECL是基于桥联免疫原性检测中最流行的技术平台,但昂贵的设备和试剂仅由一家供应商提供,其实用性受到限制。我们开发并验证了一个ELISA检测方法用来评估食蟹猴血清中的抗曲妥珠抗体。

       该方法满足免疫原性分析指导原则的要求,方法灵敏度为10.3 ng/mL( 小于100 ng/mL) ,在未酸解的情况下具有100倍的药物耐受性(曲妥珠单抗 / 抗曲妥珠单抗:10μg/mL / 100ng/mL);筛选临界值( Screening Cut Point,SCP )为1.30,确证临界值 ( Confirmatory Cut Point,CCP )为40.6%;在3.2~4000ng/mL区间无钩状效应;利用该方法进行SCP- Selectivity及CCP- Selectivity 验证试验结果均为100%通过。

实验方法

方法:桥接免疫原性试验方法

样本类型:食蟹猴血清

样品稀释:1/12

标记抗体:地高辛标记曲妥珠单抗

                 生物素标记曲妥珠单抗

检测抗体:抗地高辛-HRP

结果

Table1. Screening Cut Point Summary

*为离群值

3名分析员在不同日期完成6个分析批,考察19个空白食蟹猴个体血清信号,计算检测值的信噪比( Signal Noise Ratio,SNR ),并用SNR去离群值,正态检验结果 P ≥ 0.05,根据SCP公式( SCP=Mean+ 1.645*SD )计算 SCP 为1.30。

Table2. Drμg Tolerance Summary

研究了药物浓度为5, 10, 20μg/mL的曲妥珠单抗下的ADA阳性对照质控品100ng/mL的信号情况,结果显示:该检测方法具有100倍的药物耐受性 ( 曲妥珠单抗 / 抗曲妥珠单抗:10μg/mL / 100ng/mL ) 。

根据上述SCP代入浓度-信噪比标准曲线进行浓度回算结果( 标准曲线的拟合方式为5参数拟合 ),其浓度平均值为方法的灵敏度; 该方法灵敏度为10.3 ng/mL,且在3.2~4000 ng/mL区间无钩状效应。

Table3. Confirmatory Cut Point Summary

*为离群值

通过对19个空白食蟹猴个体血清在2个不同浓度 ( 0.0,200.0μg/mL )曲妥珠单抗的检测结果进行计算获得Inh%,然后统计排除离群值,P检验通过后根据 CCP = Mean + 2.33*SD 计算得到CCP为40.6%。

Table4. SCP-Selectivity Summary

Table5. CCP-Selectivity Summary

*为非阴性样本


SCP的验证

通过对16个空白食蟹猴个体血清在2个不同浓度水平 ( 0.0 和 60.0ng/mL ) ADA阳性对照的检测,其中阴性样本在加入阳性对照后有100%都显示阳性结果,证明 SCP设定合理。

CCP的验证

通过对19个空白食蟹猴个体血清含60.0 ng/mLADA阳性对照在曲妥珠单抗药物的2个不同浓度水平 ( 0.0和200.0μg/mL ) 样本进行测定获得Inh%,结果显示:抑制率大于40.6%的阳性样本比例为100%。

实验结论

综上:该方法符合免疫原性分析指导原则的要求,灵敏度较高,药物耐受性好,且所使用的酶标仪检测设备和试验试剂常规不受单一供应商限制,操作可行性强,可以为抗药抗体的检测技术提供一个更加经济实用的选择。